酵母感受態細胞的制備及質粒的轉化

（1）    抽提BD和AD的相關質粒（濃度最好在100-200ng/μL）；

（2）    預先灌制好需要的平板及各種培養基；

（3）   酵母感受態的制備：

1）           將酵母菌株(AH109或者是其他的菌株)在YPDA培養基平板上劃線，30℃倒置培養3天左右，直到克隆大小為2-3mm；

2）           挑取一個酵母克隆于7.5ml的YPDA液體培養基中（50ml滅菌的離心管），30℃并且振蕩(轉速200rpm)培養24h左右；

3）           將這7.5ml菌液接入大體積（體積視轉化個數確定）YPDA液體培養基中6h左右，30℃  200rpm 振蕩培養；

4）           室溫4000rpm離心5min以收集菌體，倒去上清并用40ml無菌去離子水重懸酵母；

5）           室溫4000rpm離心5min以收集菌體，倒去上清并用3ml 1.1×TE/LiAc溶液重懸酵母；

6）           將重懸液分裝為2個1.5ml的離心管，4000rpm離心1min；

7）           倒去上清，并將酵母重懸于600ul1.1×TE/LiAc溶液；

8）           在一個1.5ml滅菌的干凈離心管中加入以下組分；

10ul herring testes carrier DNA (使用前在95°C水浴鍋中變形10分鐘,立即放在冰上5min,以后使用，就不需要變性),具體設置的實驗如下:

	實驗組	陰性對照1	陰性對照2	用量
1	BK-bait	pGBKT7	BK-bait	0.2ug
2	AD-prey	AD-prey	pGADT7	0.1ug

 9) 將100ul 感受態細胞加入到DNA中；

10)加入600ul PEG/LiAc solution 快速徹底的混勻；

11) 放置于30℃并且振蕩(轉速200rpm)培養30分鐘；

12) 每管加入70μl DMSO，輕輕上下顛倒混勻,42℃水浴熱激15分鐘；

13) 冰浴2分鐘, 4000rpm，2分鐘離心收集菌體，棄上清；

14)用500ul TE（PH 8.00）重懸菌體，離心4000rpm，2分鐘離心收集菌體，棄上清，最后用50ul TE重懸菌體涂布于相應的SD-Trp/-Leu固體平板上，30℃ 倒置培養 3天左右，直到長出所需大小的克隆；

15）挑取平板上大小合適的克隆，并在700ul的SD-Trp/-Leu液體培養基中30℃震蕩過夜培養，然后按1:10,1:100,1:1000的稀釋比轉移到SD-Trp/-Leu/-His及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade固體培養基上培養，大約2天左右即可看到菌落的生長情況

16）對于在SD-Trp/-Leu/-His或者是SD-Trp/-Leu/-His/-Ade培養基上生長良好，而陰性對照沒有生長的平板可以照相保存（若有由于His滲漏表達造成的背景雜菌，可在培養基中加入1mM  3-AT進行抑制）。

酵母相關試劑的配制：

1    YPD培養基（1L）

PEPTONE                 20g

Yeast extract               10g

加ddH2O 溶解后，定容至1L,并用KOH調PH至5.80，（若為固體加入Agar  20g），高壓滅菌。如要鋪置平板，則在稍冷卻后加入40％的葡萄糖溶液（終濃度2％）。

1 2.     YPDA培養基（1L）

1L YPD液體培養基中加入15ml 0.2％Adenine hemisulfate 溶液（終濃度為0.03％）

1 3.     SD-Trp/-Leu和SD-Trp/-Leu/-His培養基的配置（1L）

Minimal SD base（Clontech）    26.7g

SD--Trp/-Leu    0.64g，SD-Trp/-Leu/-His   0.62g及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade   0.60g

加水溶解并定容至1L,并且調pH到5.80，若為固體培養基則加入20g Agar（終濃度2％），并高壓滅菌（121°C 滅菌15min）

1 4.      1.1 ×TE/LiAc

現配現用：1.1ml  10×TE和1.1ml 1M  LiAc ,用無菌去離子水補充至10ml。

1 5.      PEG/ LiAc

現配現用：1ml  10×TE和1ml 1M  LiAc ,然后用50％ PEG3350 溶液補至10ml

 

注意問題：

1 做酵母時，1.1 ×TE/LiAc，PEG/ LiAc混合溶液都需要現配現用；

2 當目的蛋白在LT長得比較少，可考慮提高酵母感受態的濃度；

3 在加入DMSO以后，切記不要劇烈的震蕩，否則影響感受態的效率；

4 所有的步驟都是在超凈臺中進行，防止其他雜菌污染；

5 SD--Trp/-Leu，SD-Trp/-Leu/-His 及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade 加水溶解并定容至1L,并且調pH到5.80，務必要調節pH，否則到時候涂板時，后出現培養基很松軟，導致涂板時，培養基破裂變成渣渣，耽誤實驗；?

  6.當目的蛋白出現自激活時，有以下解決方法：

    1)   加入一定濃度的3AT（如1mM）；

    2)   如果目的蛋白在AD上有自激活，就換到BD那一邊；

    3） 可以放在25°C培養；

    4） 如果還是解決不了，考慮截短目的蛋白。