酵母雙雜交文庫(kù)篩選

相關(guān)應(yīng)用 ：

蛋白的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是以酵母的遺傳分析為 基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相互作用對(duì)真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實(shí)驗(yàn)。很早就已知道，轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA 上特異的序列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA 結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄活化蛋白上兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain, BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(Activation Domain,AD)分別來完成的，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄活化都是必須的。目前酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)采用的系統(tǒng)有LexA 系統(tǒng)和Gal4 系統(tǒng)兩種。在LexA 系統(tǒng)中，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一個(gè)完整的原核蛋白LexA 構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域則由一個(gè)88 個(gè)氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42 構(gòu)成，它在酵母中可以活化基因的轉(zhuǎn)錄; 在Gal4 系統(tǒng)中，BD和AD 分別由Gal4 蛋白上不同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(1-147aa 與768-881aa)構(gòu)成。在利用GAL4 系統(tǒng)篩選cDNA 文庫(kù)或研究蛋白間的相互作用時(shí)，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即"誘餌"相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫(kù)蛋白或要驗(yàn)證的蛋白相結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. cDNA文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

2 .誘餌載體的構(gòu)建 

3 .誘餌質(zhì)粒的自激活檢測(cè)

4 .文庫(kù)質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞 

5 .文庫(kù)篩選（mating或共轉(zhuǎn)）

6 .文庫(kù)篩選結(jié)果測(cè)序分析

7 .篩選結(jié)果回轉(zhuǎn)驗(yàn)證(選做)

8.詳細(xì)報(bào)告的整理和數(shù)據(jù)發(fā)送

9 .交付結(jié)果