膜體系酵母雙雜交文庫構建

一. 相關應用

酵母雙雜交(yeast two hybrid) 技術是利用酵母遺傳學方法分析蛋白質之間的相互作用，已被廣泛應用于蛋白質組學、細胞信號轉導和功能基因組學等領域，已成為分子生物學研究領域的重要實驗手段。該方法建立以來，經過不斷的完善和發展，不但可以檢測已知蛋白質之間的相互作用，更重要的在于發現與已知蛋白相互作用的未知蛋白。目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實驗發現的。 而文庫篩選結果直接由文庫質量的好壞所決定，構建出高質量的文庫是得到好的篩選結果的關鍵因素， 但是，傳統的酵母雙雜交系統僅限于核蛋白的互作分析，不能進行膜蛋白互作的研究。

但是，傳統的酵母雙雜交系統(核體系)僅限于核蛋白的互作分析，無法檢測胞膜蛋白 質間相互作用，不少蛋白質需在內質網或細胞質中經過轉錄后修飾，才能與其他蛋白質 發生相互作用，傳統的酵母雙雜交無法檢測，有些蛋白質本身就是轉錄激活因子，可以對報告基因的表達進行調控，傳統的酵母雙雜交也無法檢測。
 DUALmembrane  系統 (DUALmembrane system)由瑞士的Dualsystems Biotech AG 公司開發出來，是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的膜蛋白酵母雙雜交系統，它提供了不同于常規酵母雙雜交系統的蛋白體內分析方法，使得分析膜蛋白間的互作成為現實。我們采用DUALmembrane膜蛋白酵母雙雜交系統，DUALmembrane 技術突破了傳統酵母雙雜交的局限，擴大 了酵母雙雜交的應用范圍。主要特點是可以進行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白間的互作研究。它既可以用于表達文庫的篩選，也可以應用于兩個已知蛋白(其中一個屬于膜蛋白)間互作關系的驗證。

 

 

 

 

二．實驗原理
該系統由分離的泛素(split-ubiquitin)介導膜蛋白互作信號的識別。泛素是一種含76個氨基酸的保守蛋白，它經常作為降解信號連接在蛋白質的N端。泛素能被其特異性的蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, UBPs)識別并從所連接的蛋白上切割下來，切割位點總是位于泛素蛋白的C端。在酵母細胞中，泛素可以分成兩部分分別表達，即其N端部分(NubI,第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub，第35~76位氨基酸)，后者融合了啟動核內報告基因表達的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在細胞中組成可分離的泛素蛋白([NubI:Cub]-reporter)體系。

野生型NubI與Cub具有高親和力并能自發重組形成異源二聚體。當野生型NubI的第13位異亮氨酸被丙氨酸或甘氨酸取代后，NubG與Cub之間的親和力降低。于是NubG與Cub-LexA之間只有依靠蛋白互作而連接起來，兩個互作蛋白分別與NubG和Cub-LexA融合。這樣，通過檢測轉錄因子LexA的切割就可以檢測兩個蛋白之間的互作關系，該系統工作原理示意圖如圖1。當位于細胞內質網膜上的兩個蛋白發生相互作用時，分別融合于其氨基酸C端的泛素蛋白前半部分(Cub)和后半部分(NubG)因距離靠近而形成一個完整的泛素蛋白分子，于是誘導UBPs識別并于其C端進行剪切，從而釋放出轉錄因子LexA，最終啟動核報告基因(HIS3和lacZ)的轉錄。HIS3作為營養缺陷型選擇標記，而lacZ轉錄后的β-Gal活性則作為陽性克隆的主要選擇性標記。VP16作為誘餌融合蛋白的識別標簽用于融合蛋白的表達和定位檢測。

 

 

三．交付結果：

產品名稱	交付形式	交付標準	運輸條件	儲存條件
文庫構建報告電子版；		Word或PDF格式		常溫
文庫構建圖片		JPG格式		常溫
酵母轉化報告電子版	2ml凍存管（3管）	Word或PDF格式		常溫
初級文庫質粒	2ml凍存管（1管）	>100ug	干冰	-80℃
次級文庫菌液	2ml凍存管（3管）	20%甘油	干冰	-80℃
次級文庫質粒	2ml凍存管（1管）	>100ug	干冰	-80℃
酵母工作液	2ml管（100管）		干冰	-80℃
酵母母液	50ml管（3管）		干冰	-80℃
篩庫的菌液和質粒	各1管		干冰	-80℃

  

酵母雙雜交文庫質量指標：

文庫容量1*10⁷ CFU ； 重組率：≥95 % ；插入片斷平均大于1.2 kb。

四．項目周期?     

 25-30個工作日內，如需轉化酵母延長10個工作日。

五．技術特色

1. 采用同源重組的方法構建文庫，沒有經過任何的內切酶切割和連接過程，確保不會出現基因被酶切切斷的情況，能夠保證基因的完整性。 

2.  承諾原始庫的庫容量在0.5-1*10⁷以上，而且重組的方式假陽性很低， 承諾陽性率大于 95%。 

 

六. 重要提醒

1. 客戶收到我們寄去的產品需檢查干冰是否充足，菌液是否有溶解現象，如果沒有干冰，文庫質量會受到很大影響，要盡快跟我們聯系采取補救措施。

2. 客戶拿到我們提供的所有產品均需-80℃保存，酵母菌液一定不能反復凍融。

3. 客戶拿到我們的文庫需盡快涂 SD/-Leu 平板驗證文庫滴度，如果文庫滴度達到 107

 

七．常見問題及解決方案 

1.如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎么辦？

在某些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長得很好。首先重懸克隆于 1ml 的 SD/–Trp，接著將重懸液平鋪于 5 個 100-mm 的 SD/–Trp 平板，在 30℃下溫浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用 5ml 0.5X YPDA 刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中，這樣就可以使用這個細胞重懸液進行正常的雜交反應。

 

2. 如果誘餌蛋白能直接激活報告基因的表達，該如何處理？

該蛋白很可能有轉錄激活域，是個轉錄因子?？梢酝ㄟ^基因重組切掉轉錄激活域，然后重新檢測其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

 

3. 轉化效率太低怎么辦？

1) 檢測一下 DNA 的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。

2) DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。

3) 不適當的培養基，重新配制培養基，并做對照轉化。

4) 檢測 pGBT9 對照載體的轉化效率，放置于 SD/–Trp 平板上，轉化效率應該在 1 x 10⁵ colonies/mg DNA 以上。

4. 雜交效率不高，該如何處理？

在雜交中，預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠。當對誘餌菌株進行液體培養過夜時，應挑選大的、新鮮的克隆進行培養，經過離心和重懸后，再使用血球計對細胞進行計數。密度應該在 1 x 10⁹/ml。一個甚至兩個融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。